应用案例（质量光度计-MP）：质量光度计测量蛋白质的变性

Characterization of protein interaction equilibria

翻译整理：北京佰司特科技有限责任公司

质量光度计量化了溶液中生物分子的质量分布。在自然条件下，已确定其用于分析生物样品的纯度、完整性和功能。然而，其在变性条件下的性能尚未得到*评估。在本申请说明中，我们证明质量光度计是研究低聚物蛋白质变性（去折叠）和复性（再折叠）的有用工具。通过化学变性破坏蛋白质的天然结构可以深入了解蛋白质和复合物的结构和稳定性。尿素和盐酸胍（GdnHCI）等化学变性剂通过改变蛋白质疏水残基暴露于周围水溶液中，促进蛋白质的变性（去折叠）。虽然化学变性在生物化学研究中已经用了几十年，但由于其涉及大量分析技术，操作成本高，灵敏度低，数据分析和解释太复杂，因此对变性（去折叠）和复性（再折叠）的监测仍然具有挑战性。

在本应用说明中，我们探讨了质量光度计（MP）的功能，以快速获得有关蛋白质去变性（去折叠）和复性（再折叠）的直观结果。与所有MP应用一样，测量过程只需极少量样品，就可以方便地测试各种变性条件。为了举例说明MP在非折叠/复性实验中的优势和局限性，我们对烯醇化酶进行了研究，这是一种已知可进行可逆变性的蛋白质。

质量光度计对结构不敏感

MP是一种超灵敏的单分子显微镜技术，用于检测玻璃-水界面溶液中蛋白质（或其他生物分子）的散射信号。落在该界面上的粒子散射的光量取决于粒子的质量，而不是其形状。无论蛋白质是折叠的还是未折叠的，其质量都保持不变，MP读数也保持不变。

我们在天然和变性条件下对烯醇化酶的MP测量表明MP对蛋白质折叠状态不敏感。在自然条件下，烯醇化酶主要形成约93 kDa质量的二聚体和一些约46 kDa质量的单体。在变性条件下（尿素），二聚体分离成大部分未折叠的单体。然而，正如预期的那样，未折叠单体的质量（通过MP测量（〜46 kDa））与折叠单体的质量相同（图1）。MP对折叠状态的不敏感使其成为监测折叠相关寡聚的可行方法。

高浓度变性剂会影响光学测量

蛋白质去折叠实验通常在非常高浓度的变性剂下进行。然而，当尿素和GdnHCI在水溶液中浓度较高时，会形成氢键聚集。这种团簇可以用MP观察到，因为聚集体的光学性质不同于周围溶液的光学性质。这种差异导致背景光散射，在比率MP图像中表现为图案（图2）。随着尿素浓度的增加，图案及其相应的信号也增加，直到浓度超过1M尿素时达到平台（图2）。

来自聚集体的图案信号表示背景噪声，这将使使用MP测量生物分子的质量更加困难。MP测量的散射信号甚至可能不再是可量化的，尤其是对于接近探测下限的较小物体。因此，在使用变性剂时，检查背景信号非常重要，这将为实验设置噪声基线。以下章节描述了如何使用稀释去除变性剂背景信号。

质量光度计揭示复性动力学

当变性剂背景被稀释时，MP可以对变性过程提供有价值的分析，从而可以监测低聚蛋白质的复性动力学。烯醇化酶在自然条件下主要是二聚体，在变性条件下24小时后几乎*是单体。当变性烯醇化酶样品通过PBS稀释回到接近自然条件时，MP质量分布图捕捉到了这种变化（图3）。稀释后立即进行第一次测量，这得益于MP的快速性及其在宽质量范围内准确执行的能力。

我们还能够使用MP监测变性烯醇化酶样品的复性动力学，显示二聚体在稀释后的最初60分钟内逐渐重新形成（图3）。二聚体回复动力学可以通过绘制单体/二聚体比率随时间的函数来可视化。回收率取决于所使用的变性物质，用GdnHCI变性的烯醇化酶恢复得更快（图4）。回复过程提供了有关蛋白质相互作用以及不同变性物质如何影响蛋白质相互作用的重要信息。

这项研究表明，即使在未折叠状态下，MP也能提供有关生物分子和复合物的质量和组成的宝贵信息。MP提供了一种简单的方法来监测多聚体复合物中蛋白质的变性和复性过程，并很容易比较变性剂的效果。