一、实验前准备：环境与试剂质控

 

荧光定量PCR对污染和试剂纯度极其敏感，此阶段的核心是避免交叉污染、确保试剂有效性。

 

实验环境准备

 

划分独立操作区域：严格区分“样本处理区”“试剂配制区”“PCR扩增区”，避免气溶胶污染（如扩增后的产物扩散到前序步骤）。各区需配备专用移液器、耗材（吸头、离心管），并定期用紫外线（UV）或核酸清除剂消毒台面和仪器。

 

仪器检查：提前调试荧光定量PCR仪，确认温度准确性（如梯度验证）、荧光通道灵敏度（用标准品测试信号强度），确保仪器运行稳定。

 

试剂与耗材准备

 

试剂选择与储存：根据实验目的（如DNA定量、RNA定量、基因表达分析）选择合适的qPCR试剂盒（含DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、荧光探针/染料），以及逆转录酶（仅RNA实验）、引物、探针、RNase抑制剂等。所有试剂需按说明书储存（如-20℃冷冻保存，避免反复冻融，建议分装成小份使用）。

 

耗材质控：使用无RNase、无DNase的无菌吸头和离心管，避免核酸酶降解模板；吸头需带滤芯（防止移液器内气溶胶污染）。

 

二、样本处理：模板核酸提取与纯化

 

模板的纯度和完整性直接影响qPCR结果，此阶段需高效提取核酸并去除杂质。

 

样本类型与预处理

 

常见样本包括组织、细胞、血液、唾液、体液等。根据样本类型进行预处理：如组织需研磨匀浆、细胞需胰酶消化收集、血液需离心分离血清/血浆或白细胞。

 

预处理过程中，RNA样本需全程加入RNase抑制剂，避免RNA降解；样本需新鲜处理，若无法立即提取，需按要求保存（如组织样本-80℃冷冻，RNA样本溶于RNase-free水或TE缓冲液）。

 

核酸提取

 

采用商业化提取试剂盒（如柱提法、磁珠法）或经典方法（如酚氯仿法）提取DNA或RNA。核心步骤包括：裂解细胞释放核酸→结合到吸附柱/磁珠上→洗涤去除蛋白质、盐类、有机溶剂等杂质→洗脱得到纯净核酸。

 

提取后需检测核酸质量：用紫外分光光度计测OD值（DNA的OD260/280比值应在1.8~2.0，RNA应在1.9~2.1，比值异常提示蛋白或杂质污染）；用琼脂糖凝胶电泳检测核酸完整性（如RNA需观察28S和18SrRNA条带，确保无降解）。

 

三、逆转录（RT步骤）：RNA→cDNA（仅RNA模板适用）

 

若检测对象为RNA（如基因表达量分析、病毒RNA定量），需先将RNA逆转录为稳定的cDNA，再进行qPCR扩增。

 

逆转录反应体系配制

 

在无RNase的离心管中，按比例加入以下成分：RNase-free水、RNA模板、Oligo(dT)引物/随机引物、dNTPs、RNase抑制剂、逆转录酶、逆转录缓冲液。体系需在冰上配制，避免酶活性提前激活。

 

引物选择：Oligo(dT)结合mRNA的poly(A)尾，适用于完整mRNA逆转录；随机引物可结合RNA任意区域，适用于降解RNA或非编码RNA逆转录。

 

逆转录反应程序

 

按逆转录酶说明书设置PCR仪程序，典型程序为：

 

引物退火：25~37℃孵育10~15分钟（让引物与RNA结合）；

 

逆转录延伸：42~50℃孵育30~60分钟（逆转录酶合成cDNA）；

 

酶灭活：70~85℃孵育5~10分钟（终止反应并灭活逆转录酶）。

 

反应结束后，cDNA可立即用于qPCR，或-20℃冷冻保存（短期）、-80℃长期保存。